溴乙啡锭二聚体-I（EthD-I，红色）是一种高亲和性的荧光核酸染料，与 DNA 或 RNA 结合后，可以使荧光增强 30 多倍。用于哺乳动物、细菌、酵母和真菌的染色。EthD-I 带有较强正电荷，所以该染料不能穿过细胞膜进行活细胞染色，但是能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核并且嵌入 DNA 双链从而产生红色荧光。因此 EthD-I 可以准确的检测溶液中的核酸或者解体细胞中的核酸，是一种较灵敏的核酸染色剂。

一、EthD-I 的分子特性与标记原理

EthD-I（溴乙啡锭二聚体 - I）是一种红色荧光核酸染料，属于乙啡锭类衍生物，分子量约 1,400 Da。其分子结构包含两个乙啡锭单元，通过柔性链连接，可与双链 DNA 结合后发射红色荧光（激发 / 发射波长约 528/617 nm）。核心优势源于膜非透性、高荧光增强效应及死细胞特异性标记，尤其适合区分活细胞与死亡细胞。

二、死亡细胞标记的特异性与高效性

1. 膜非透性与死亡细胞选择性

EthD-I 无法穿透完整的细胞膜，仅能进入细胞膜破损的细胞（如坏死细胞、晚期凋亡细胞或机械损伤细胞），与 DNA 结合后发出强红色荧光，因此可特异性标记死亡细胞，避免活细胞干扰。

与 Annexin V 联用时，可构建 “活细胞（-/-）、早期凋亡（Annexin V+/EthD-I-）、晚期凋亡 / 坏死（Annexin V+/EthD-I+）” 的三群分类，精准划分细胞死亡阶段。

2.高荧光增强与信号稳定性

未结合 DNA 时，EthD-I 荧光极弱；与 DNA 结合后，荧光强度增强约 40 倍，信噪比高，即使少量死亡细胞也能被灵敏检测。

荧光信号在固定细胞中可维持数天，抗光漂白能力优于 PI，适合长时间成像或批量样本处理。

三、光谱特性与多色实验兼容性

1. 红色荧光的低干扰优势

发射波长 617 nm，远离细胞自发荧光（多为蓝色 / 绿色），在组织样本或荧光蛋白共表达实验中背景噪音低，尤其适合与 GFP、FITC 等绿色探针联用，光谱串扰率＜3%。

穿透性适中（红色光），在组织切片中穿透深度可达 20-50 μm，优于蓝色荧光染料（如 DAPI）。

2.多参数分析适配性

流式细胞术兼容性：可与 APC、PE 等红色荧光探针同时检测，通过 610 nm 带通滤光片分离信号，适合多色实验（如 EthD-I+CD3-APC+Annexin V-FITC 分析 T 细胞死亡表型）。

四、典型应用场景

1. 细胞毒性与药物筛选

高通量检测抗癌药物对肿瘤细胞的杀伤效率：EthD-I 染色后通过流式细胞术或荧光显微镜计数死亡细胞比例，IC₅₀测定的灵敏度比台盼蓝染色高 10 倍。

2.免疫细胞死亡机制研究

在 T 细胞与肿瘤细胞共培养体系中，EthD-I 标记死亡肿瘤细胞，结合 CD8-PE 标记活化 T 细胞，分析免疫杀伤效率与死亡方式（凋亡 vs. 坏死）。

3.组织损伤与病理诊断

心肌梗死模型中，EthD-I 标记梗死区死亡心肌细胞，配合 WGA-Alexa Fluor 488 标记细胞膜，评估损伤面积与存活细胞边界。

4.微生物活性检测

在细菌或真菌培养中，EthD-I 区分活菌与死菌，尤其适合抗微生物药物（如抗生素）的杀菌动力学研究（如 1 小时内的死亡细胞比例变化）。

五、技术优化与注意事项

1. 染色时机与浓度：工作浓度通常为 1-10 μM，样本染色后需在 1 小时内检测，避免长时间放置导致细胞膜通透性增加，非死亡细胞被误标记。
2. 流式细胞术设置：建议使用 488 nm 激光激发，610/20 nm 带通滤光片收集信号，补偿设置中需调整 FITC 与 EthD-I 的交叉污染（通常＜5%）。
3. 组织样本处理：冰冻切片染色时，建议先固定（4% 多聚甲醛）再染色，减少组织处理过程中的细胞机械损伤导致的假阳性。

总结

EthD-I 通过 “膜非透性 + 高荧光增强” 的设计，成为死亡细胞标记的高效工具，尤其在需要精准区分活细胞与死亡细胞的场景中优势显著。其红色荧光特性、光稳定性及多色兼容性，使其在细胞毒性检测、免疫杀伤分析及病理诊断中具有不可替代的价值，相比传统死亡染料（如 PI），能提供更可靠的死亡细胞定量数据。