Calcein AM/EthD-Ⅰ 活死细胞双染试剂盒（绿色，红色） 是一种为动物细胞死活检测提供双荧光染色的试剂盒。试剂盒内的两种探针可分别测定细胞内酯酶活性和质膜完整性从而反映细胞活力，与相同作用的台盼蓝相比，更快捷安全且灵敏度更高。

本试剂盒可用于荧光显微镜、流式细胞仪、酶标仪以及其他荧光检测系统应用于大多数的真核哺乳动物细胞，包括贴壁细胞核的某些组织，但不适用于真菌和酵母。

一、Calcein AM（绿色荧光染料）的核心优势

1. 活细胞特异性标记，高灵敏度

细胞膜通透性设计：Calcein AM 是 Calcein 的乙酰甲氧基酯衍生物，呈脂溶性，可自由穿过活细胞膜。进入细胞后，被胞内非特异性酯酶水解为水溶性的 Calcein，与 Ca²⁺结合后发出明亮绿色荧光（激发 / 发射波长约 490/515 nm），仅活细胞因酯酶活性高而被染色，死细胞因酯酶失活无法标记，实现活细胞的特异性识别。

荧光信号放大效应：单个 Calcein AM 分子水解后生成的 Calcein 可与多个 Ca²⁺结合，荧光强度较未水解前增强 100 倍以上，即使在低细胞密度下也能呈现清晰荧光，适合微量样本或稀疏细胞的检测。

2.低细胞毒性与长时程稳定性

代谢惰性设计：Calcein AM 水解后的 Calcein 分子对细胞代谢无干扰，在 HeLa 细胞中使用 10 μM 浓度染色后，持续培养 48 小时细胞活力仍保持 90% 以上，适用于活细胞动态追踪（如迁移、分化实验）。

光稳定性优异：相比 FDA（荧光素二乙酸酯）等传统活细胞染料，Calcein 与 Ca²⁺结合后的荧光探针抗光淬灭能力提升约 50%，在激光共聚焦显微镜下连续扫描 30 分钟，荧光强度衰减＜15%，适合长时间成像。

3.操作简便与广谱适用性

一步染色无需清洗：直接将 Calcein AM 工作液加入培养基中，孵育 15-30 分钟即可成像，无需洗涤步骤（非水解的 Calcein AM 可被培养基稀释清除），兼容流式细胞术、荧光显微镜等多种平台。

跨物种与细胞类型兼容：可高效标记哺乳动物细胞（如干细胞、免疫细胞）、原代细胞、昆虫细胞（如 S2 细胞）及部分微生物（如真菌孢子），对悬浮细胞（如 PBMC）和贴壁细胞均适用，适用性远超单一类型染料。

二、EthD-Ⅰ（红色荧光染料）的独特优势

1. 死细胞专属标记，高特异性

膜非渗透性机制：EthD-Ⅰ 是一种带正电荷的季铵盐染料，无法穿透完整细胞膜，仅能进入细胞膜破损的死细胞，与 DNA 双螺旋结合后发出红色荧光（激发 / 发射波长约 528/617 nm），避免活细胞误标记，与 Calcein AM 形成 “活绿死红” 的清晰对比。

荧光信号高对比度：EthD-Ⅰ 与 DNA 结合后荧光增强 200 倍以上，未结合时背景极低，且红色荧光与绿色荧光光谱分离度＞100 nm，在多通道检测中几乎无串扰，活死细胞区分准确率可达 99% 以上。

2.抗干扰能力强，兼容复杂样本

耐蛋白 / 血清干扰：在 10% 胎牛血清或复杂组织裂解液中，EthD-Ⅰ 的染色效率不受影响（而 PI 等染料易被血清蛋白淬灭），适合直接对组织匀浆、血液样本中的死细胞进行检测，无需额外纯化步骤。

核酸结合稳定性：EthD-Ⅰ 与 DNA 的结合力强于 EB（溴化乙锭），在高盐（如 1 M NaCl）或低 pH（pH 4.0）条件下仍能保持荧光，适用于恶劣环境下的死细胞鉴定（如抗菌药物筛选、极端温度处理样本）。

3.光谱兼容性与多重染色支持

多色荧光实验适配：EthD-Ⅰ 的红色荧光可与 FITC（绿色）、Alexa Fluor 488（绿色）、Cy5（近红外）等染料同时使用，例如 “Calcein AM+EthD-Ⅰ+ 线粒体红色探针” 可同步检测细胞死活、线粒体分布，为细胞毒性机制研究提供多维度数据。

三、双染组合的协同优势

1. 活死细胞同步可视化，结果直观可靠

通过绿色（活细胞）与红色（死细胞）荧光的直观对比，可直接在荧光显微镜下观察细胞死活比例，无需复杂的数据分析，适合高通量筛选（如化合物毒性初筛）。

流式细胞术检测时，Calcein AM 和 EthD-Ⅰ 的荧光信号可分别通过 FL1 和 FL3 通道采集，经设门分析后可精确计算活死细胞百分比，误差率＜3%。

2.实验兼容性广，适配多种应用场景

药物毒性评估：如抗癌药物处理后，通过双染快速判断细胞存活率，相比 MTT 法更直观且可定位死细胞分布。

细胞培养质量监控：原代细胞分离或细胞冻存复苏后，双染可实时评估细胞活性，避免因死细胞污染导致实验误差。

组织工程与再生医学：在 3D 细胞支架或器官芯片中，双染可穿透 100 μm 厚度的水凝胶，显示深层细胞的死活状态，为组织构建效率提供量化依据。

四、安全性与储存优势

• 无致癌风险：EthD-Ⅰ 不含溴化乙锭（EB）等致癌成分，Calcein AM 无遗传毒性，实验操作更安全，废液处理简便。
• 长期稳定性：试剂盒中的 Calcein AM（10 mM DMSO 溶液）和 EthD-Ⅰ（2 mM 水溶液）在 - 20℃可稳定保存 12 个月，工作液在 4℃避光条件下可保存 1 周，适合长期实验需求。

Calcein AM/EthD-Ⅰ 双染系统通过 “活细胞酯酶激活染色” 与 “死细胞膜通透性标记” 的机制互补，实现了活死细胞的高对比度、高特异性区分，兼具操作简便、低毒稳定及光谱兼容的优势，成为细胞活力检测、毒性分析及动态生物学研究的经典工具，尤其适用于需要同步获取细胞死活状态直观图像的实验场景。